色欲人妻AAAAAAA无码_国产 中文 制服丝袜 另类_久久人人爽爽爽人久久久_久久亚洲精品无码aⅴ大香

Q-流程(cheng)：

一(yi)、 ①實驗前準備(bei)，每天早(zao)上到實驗室后，先把超(chao)(chao)(chao)凈工作(zuo)臺(tai)(tai)(tai)(tai)的(de)紫外燈打(da)開15-20分鐘。②超(chao)(chao)(chao)凈臺(tai)(tai)(tai)(tai)前做實驗，需佩戴干凈的(de)橡膠手(shou)套/一(yi)次性薄膜手(shou)套，RNA 抽提(ti)需帶(dai)口罩。③取(qu)EP管/槍(qiang)(qiang)頭時需用(yong)(yong)(yong)鑷子，不可以(yi)用(yong)(yong)(yong)使用(yong)(yong)(yong)過(guo)(guo)的(de)手(shou)套直接取(qu)用(yong)(yong)(yong)。取(qu)完(wan)EP管/槍(qiang)(qiang)頭后，袋子及時封好。④橡膠手(shou)套須(xu)放入超(chao)(chao)(chao)凈臺(tai)(tai)(tai)(tai)照射紫外，實驗操 作(zuo)過(guo)(guo)程中不得帶(dai)出(chu)超(chao)(chao)(chao)凈臺(tai)(tai)(tai)(tai)，移(yi)液器在一(yi)天工作(zuo)結束后調至最(zui)大量程，并(bing)用(yong)(yong)(yong)75%乙醇清潔移(yi)液器，槍(qiang)(qiang)頭盒及超(chao)(chao)(chao)凈臺(tai)(tai)(tai)(tai)面。⑤實驗進(jin)行(xing)的(de)過(guo)(guo)程中或(huo)觀(guan)看實驗時，沒有帶(dai)口 罩不要(yao)在超(chao)(chao)(chao)凈臺(tai)(tai)(tai)(tai)前講話(hua)。

二(er)、 總抽提(ti)

1)細(xi)胞培養皿中細(xi)胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸(xi)干凈(jing)，加入1ml Trizol ()溶(rong)液，吹打混(hun)勻，并吸(xi)至1.5ml RNase free EP管中使細(xi)胞充分裂解(jie)，室溫靜置5min;

如(ru)使(shi)用組織樣(yang)(yang)品(pin)，則先用液氮充分研磨組織樣(yang)(yang)品(pin)，然(ran)后加入1ml Trizol (Invitro)溶液，混(hun)勻，室溫(wen)放置5min使(shi)其(qi)充分裂解;(管蓋(gai)與管壁都需標(biao)記樣(yang)(yang)品(pin)名(ming)稱(cheng))

2)加入200μl氯(lv)仿，劇(ju)烈振蕩混(hun)勻30s，使水相(xiang)和有機相(xiang)充(chong)分接觸，室溫(wen)靜置3-5min;(離心(xin)(xin)時按順(shun)(shun)序(xu)(xu)(xu)排放，離心(xin)(xin)完畢，離心(xin)(xin)管的(de)順(shun)(shun)序(xu)(xu)(xu)也按順(shun)(shun)序(xu)(xu)(xu)排好，與第一步的(de)順(shun)(shun)序(xu)(xu)(xu)一致(zhi))

3) 4℃下，14,000g離(li)心(xin)15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個(ge)新的RNase free EP管;(用20-200ul的槍(qiang)吸取上清，吸上清時，槍(qiang)頭(tou)應(ying)沿著液面(mian)上層吸取上清，槍(qiang)頭(tou)不可碰(peng)到(dao)、吸到(dao)中(zhong)間層)

4)沉淀RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地(di)充分混勻(yun)(顛(dian)倒6-8次)(不(bu)應用振蕩器(qi)混勻(yun))，室溫(wen)靜置(zhi)10min;

5)4℃下(xia)，14,000g離(li)心(xin)10min，收集RNA沉(chen)淀(如離(li)心(xin)后仍(reng)不見EP管底部有沉(chen)淀，應將EP管放(fang)置在(zai)-80度冰箱過夜(ye)，繼(ji)續在(zai)4℃下(xia)，14,000g離(li)心(xin)10min，收集RNA沉(chen)淀)，去(qu)上清;

6)用(yong)75%乙醇洗滌兩次(ci)(12,000g離心5min)(加(jia)入(ru)乙醇后只需輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)顛(dian)倒EP管(guan)即可，不用(yong)振蕩器(qi)震蕩或(huo)槍頭(tou)吸打沉(chen)淀)，超(chao)凈(jing)臺風干;沉(chen)淀不能過(guo)干或(huo)過(guo)濕，過(guo)干則不易溶解，過(guo)濕則乙醇殘留(liu)。

7)視沉(chen)(chen)淀量加入適量DEPC水(至少15ul)溶(rong)解沉(chen)(chen)淀。

三、去

使用RNase-free的DNase ?(Promega)，按以下體系配置反(fan)應(ying)液(ye)，37℃消化30min，65℃滅(mie)活(huo)10min。

然后(hou)按以下步驟操作：

1) 加入等(deng)體積的苯酚/氯(lv)仿，上下顛倒混(hun)勻，室溫放置(zhi)5min后(hou)， 14,000rpm離心15min，取(qu)上清。

2) 加入等體積的氯仿，上下顛倒(dao)混(hun)勻，靜(jing)置(zhi)分層后14,000rpm，離(li)心15min，取上清(qing)。

3)加入等體積(ji)異丙醇，輕柔地充(chong)分混(hun)勻(顛(dian)倒6-8次(ci))，-20℃靜置(zhi)15min;

4)4℃下，14,000g離心(xin)15min，收集RNA沉(chen)淀，去(qu)上清;

5)用75%乙醇洗滌兩次(12,000g離心5min)，超凈(jing)臺風干;

6)加入適量DEPC水(至(zhi)少15ul)溶解沉淀。

四、總RNA純(chun)度和完整性檢測

1)純(chun)度(du)檢測(ce)：取1μl RNA樣品50倍稀(xi)釋，在(zai)核酸蛋白(bai)檢測(ce)儀上測(ce)定OD值，OD260/OD280的(de)(de)比值大于1.8，說明制備的(de)(de)RNA較純(chun)，無蛋白(bai)質污染(ran)。

2)總RNA完整(zheng)性檢測：取(qu)RNA樣品1μl，1%瓊脂糖凝膠電(dian)泳(yong)80V×20min，EB染色(se)10min，用凝膠成像系統(tong)觀察并拍照，總RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA條(tiao)(tiao)帶，三條(tiao)(tiao)條(tiao)(tiao)帶完整(zheng)的話(hua)即可證明總RNA抽(chou)提(ti)比較完整(zheng)。

五、逆轉錄

1、mRNA：

1) 在RNase free的(de)PCR管(guan)中配置下(xia)列溶液(ye)：

2) 將上述溶(rong)液吹打均勻，置(zhi)85℃保溫5min，使RNA變性。隨后立(li)即冰上致(zhi)冷， 以(yi)防止(zhi)RNA復性；

3) 在該PCR管中加入下列試劑(Promega)

4) 將上述20μl反應溶液30℃保溫10min；

5) 42℃保溫(wen)50min；

6) 85℃保溫10min；

7) -20℃保存。

2、microRNA：

使用莖(jing)環(huan)逆轉錄法(fa)，原理如下(xia)圖：

1) 在去RNase的PCR管中(zhong)配(pei)置以下溶液；

2)將上述溶液混勻，85℃孵育5min，以打開RNA二(er)級(ji)結構。隨后立即置于(yu)冰上，以防止RNA復性(xing)再次(ci)恢復二(er)級(ji)結構；

3) 在另(ling)一去RNase的PCR管中(zhong)配置以下溶(rong)液：

4) 將(jiang)3)溶(rong)液加入(ru)到1)溶(rong)液中，混勻后30℃保溫10min；

5) 42℃孵育50min；

6) 85℃孵育10min滅活逆轉錄酶。

六、定量PCR檢測

1、引物測試：

根據mRNA設計(ji)的引物(wu)正式實(shi)驗前需(xu)進行qPCR測試其(qi)特異性(xing)和擴增效(xiao)率(lv)，具體(ti)反(fan)應(ying)體(ti)系和反(fan)應(ying)條件如正式實(shi)驗，每對(dui)引物(wu)需(xu)做(zuo)模板水(shui)對(dui)照。

得到(dao)結果后(hou)，首先根據熔解(jie)曲線(xian)(xian)判斷引物特(te)異性(xing)(xing)，選擇標準為：單峰且峰形(xing)偏窄、水(shui)對照無明顯引物二(er)聚體(ti)熔解(jie)曲線(xian)(xian)峰。若設計(ji)的(de)多對引物熔解(jie)曲線(xian)(xian)均顯示特(te)異性(xing)(xing)良好，則(ze)應對比各引物的(de)擴增(zeng)曲線(xian)(xian)，優先選擇Ct值(zhi)小、擴增(zeng)效率高的(de)引物進(jin)行正(zheng)式實驗。

2、確定上(shang)機內容后，首先在記(ji)錄本上(shang)編排(pai)好(hao)上(shang)機的樣品排(pai)放(fang)順(shun)序(xu)。

(1)一(yi)個樣(yang)品(pin)的加樣(yang)盡可(ke)能(neng)安排(pai)在同一(yi)行；

(2)如正式實驗(yan)中三次(ci)(ci)重復不能安排在同一板上，則需(xu)把三次(ci)(ci)重復中的實驗(yan)分(fen)開，但同一次(ci)(ci)重復的實驗(yan)不能分(fen)開兩板。

3、正式實驗：

體系配制：

H2O 4ul

SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使(shi)用前需振蕩均勻(yun))

上(shang)游引物 0.5ul (10uM)

下游引物 0.5ul (10uM)

總體(ti)積 15ul

計算好實驗中(zhong)需(xu)用(yong)多(duo)(duo)少份(fen)體(ti)系，則(ze)按具體(ti)量配置。體(ti)系分(fen)裝會有損失(shi)，一般(ban)多(duo)(duo)配0.5份(fen)--1份(fen)體(ti)系。

總(zong)的體系配好后，在振(zhen)蕩器(qi)中(zhong)振(zhen)蕩均勻或用(yong)槍(qiang)吸打均勻，然(ran)后15ul每管(guan)分裝至8連管(guan)中(zhong)。

4、cDNA用(yong)滅(mie)菌純水(shui)稀(xi)釋(shi)適當的濃度，一般為1:20稀(xi)釋(shi)，如遇(yu)到基因表達(da)低的樣(yang)品，則適當降低稀(xi)釋(shi)比例至(zhi)1:10或1:5。cDNA按一定順序排好(hao) 后，即可加至(zhi)剛(gang)配好(hao)的反(fan)應體(ti)系中。加樣(yang)完畢，蓋(gai)好(hao)八連(lian)管蓋(gai)，并在八連(lian)管蓋(gai)最上沿的邊上標(biao)記好(hao)1-12的順序(不可將標(biao)記寫在反(fan)應管的蓋(gai)子(zi)上，八連(lian)管蓋(gai)避(bi)免 裸手觸摸中間透明(ming)的熒(ying)光采集區域，且保證(zheng)每(mei)孔均蓋(gai)緊，否則影響(xiang)重復性或可能出現熔解(jie)曲線峰漂(piao)移。)

5、把各排(pai)八(ba)連(lian)管放在(zai)掌上離心機上離心數秒。

七、上機：

7.1  先開電腦，進入Windows 界面。接(jie)著(zhu)打開PCR儀(yi)電源開關(guan)。

7.2  打開7500軟件(jian)，選(xuan)擇“新建”，在“Template”下拉(la)菜單中選(xuan)擇“60”或“65”(普通(tong)基因檢(jian)測為“60”，MicroRNA檢(jian)測為“65”)。

7.3  打開樣品架，放入八連管，關上(shang)樣品架，并(bing)在軟件上(shang)選擇已放反應管的孔位(wei)，剔除無(wu)反應管的孔位(wei)。

7.4  點擊File菜單中Save，輸入要(yao)保存結果的文件名(ming)(ming)，命名(ming)(ming)為日期-上機(ji)時間-客戶(hu)名(ming)(ming)字(zi)簡寫，如100830-1008-WL表示8月30日10點08分魏立(li)的實驗。

7.5  點擊Start鍵(jian)，開始運(yun)行(xing)程序。

7.6  程序運行完(wan)畢后，取(qu)出樣品架上的八連管，按順序關(guan)閉(bi)ABI PRISM ;7500 SDS 軟件、PCR儀電源開關(guan)。

7.7  在7500軟件上標記(ji)好每個反應(ying)孔的樣(yang)品(pin)名稱(cheng)及檢測基因(yin)的名稱(cheng)，分類保存好結果文件。

反(fan)應(ying)完成后，八連(lian)管應(ying)裝到封口袋中，袋子(zi)上標記好文件(jian)名(ming)，客(ke)戶(hu)的(de)(de)名(ming)字。(同(tong)一個(ge)客(ke)戶(hu)的(de)(de)三次重復實驗，則(ze)只需(xu)保存其中一次重復的(de)(de)反(fan)應(ying)管即可(ke)，其余可(ke)丟棄)