細(xi)胞(bao)(bao)(bao)培養(yang)技術指的(de)(de)是(shi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)在體(ti)外條件下的(de)(de)生長，在培養(yang)的(de)(de)過程(cheng)中細(xi)胞(bao)(bao)(bao)不再形成組織（動物）。培養(yang)物是(shi)單個(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)或(huo)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)群。細(xi)胞(bao)(bao)(bao)在培養(yang)時都要生活在人工環境中，由于環境的(de)(de)改(gai)變，細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)移動或(huo)受一些其(qi)他因素的(de)(de)影響，培養(yang)時間(jian)加長，傳代(dai)導致細(xi)胞(bao)(bao)(bao)出現單一化型。

細(xi)胞培養實驗步驟

1、完(wan)全(quan)培養基配置：培養(yang)基的配制(zhi)（需在超凈臺內無(wu)菌操作）：10%FBS+90% 基(ji)(ji)礎培養(yang)基(ji)(ji)，根據細胞培養(yang)需求選擇相應的基(ji)(ji)礎培養(yang)基(ji)(ji)。

2、細胞復蘇：

（1）把凍(dong)存管從(cong)液氮中取出來，立即投入37℃水(shui)浴(yu)鍋中(zhong)，輕微搖(yao)動(dong)。凍存液融至黃豆粒大小，拿出來噴酒精放到超(chao)凈(jing)工(gong)作臺里。

（2）把上述(shu)細胞(bao)懸液吸(xi)到裝(zhuang)5ml培養基的(de)15ml的離(li)心管(guan)中(zhong)（用培養(yang)基(ji)把(ba)凍存(cun)管(guan)洗一遍，把(ba)在壁上的細胞都洗下來），1000轉離心5分鐘。

（3）把上清液倒掉，加1ml培養基把細(xi)胞重(zhong)懸。吸到(dao)裝有10ml培(pei)養基的培(pei)養器皿中前后左右輕輕搖動，使培養瓶中(zhong)的細胞均勻(yun)分布。

（4）標好細胞(bao)種類和日(ri)期等，放到CO2培養箱中培養，細胞貼(tie)壁后換(huan)培養基。

（5）3天換(huan)一(yi)次培養基。

3、細胞傳代：

（1）培養瓶中的細胞覆蓋率達到(dao)80%-90%時要傳代。

（2）把原有培養(yang)基(ji)吸掉，用PBS洗一遍后加適(shi)當的胰蛋白酶（能覆蓋細(xi)胞），消化1-5分鐘。

（3）細胞都變圓后吸(xi)出(chu)胰酶加入培養基終止(zhi)消化。

（4）吹打細(xi)胞(bao)，使細胞(bao)都懸浮。

（5）根(gen)據細胞種類把細胞傳到幾個培養瓶(ping)中(zhong)。一般，癌細胞(bao)1傳(chuan)4，正常細胞1傳(chuan)3。繼續培養(yang)。

4、細胞凍存：把細(xi)(xi)胞消化(hua)下來并(bing)離心（同上）。用(yong)配(pei)好的凍(dong)存(cun)液把細(xi)(xi)胞懸浮起來，分裝(zhuang)凍(dong)存(cun)管中，靜止幾分鐘(zhong)，寫(xie)明細(xi)(xi)胞種(zhong)類，凍(dong)存(cun)日(ri)期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃過夜，然后(hou)放到(dao)液氮(dan)罐中保存。

凍存液(ye)的配制： 90%FBS+10%DMSO.

注：DMSO要慢(man)慢(man)滴加，邊滴邊搖。