Stbl3 Electroporation-Competent Cell 產品(pin)說明書(shu)
產品規(gui)格（CAT#: DE1046）
Stbl3 Electroporation-Competent Cell 50μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存(cun)條件(保質期)： -80℃（6個(ge)月）
基因型
F- mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (StrR) xyl-5 λ-leu mtl-1 endA1+
產(chan)品說明
Stbl3菌株來源于(yu) HB101 E. coli strain，是(shi)慢病毒載體系統推(tui)薦使用的菌(jun)株。基因組含(han)有重組酶recA13突變，可有效抑制長片段末(mo)端重(zhong)復區的(de)重(zhong)組，降低(di)錯誤重(zhong)組的(de)概率(lv)；但不含(han)核酸酶endA1突(tu)變，體(ti)內核酸(suan)酶含(han)量較高(gao)，提取(qu)質粒(li)時務必使用(yong)質粒(li)提取(qu)試劑盒中(zhong)去蛋白(bai)液盡(jin)量去除核酸(suan)酶對質粒(li)的污染。此菌株(zhu)具有(you)鏈霉素(su)抗(kang)性，不存在lacIqZΔM15，不(bu)可用于藍、白斑(ban)篩選(xuan)。唯地(di)生物生產的(de)Stbl3電擊感受態細胞經(jing)特殊工藝制(zhi)作，pUC19質粒檢測轉(zhuan)化效率可達1×109 cfu/μg DNA。
操(cao)作方(fang)法
1. 0.1 cm 電擊(ji)杯(bei)和杯(bei)蓋(gai)從儲存液(ye)中拿(na)出倒置(zhi)(zhi)于干(gan)(gan)凈的吸(xi)水(shui)紙上(shang)5分鐘(zhong)，待(dai)其瀝干(gan)(gan)水(shui)分，正置(zhi)(zhi)5分鐘(zhong)，待(dai)乙醇揮(hui)發干(gan)(gan)凈立即插(cha)入冰中，壓實(shi)冰面(mian)，電極杯(bei)頂離冰面(mian)0.5 cm以方(fang)便蓋(gai)上(shang)杯(bei)蓋(gai)，冰中靜置(zhi)(zhi)5分鐘(zhong)充分降溫。
2. 取(qu)-80℃保存(cun)的(de)Stbl3電擊感(gan)受態細胞插入冰中5 分(fen)鐘，待其(qi)融化，加入目的(de)DNA (質粒或(huo)連(lian)接產(chan)物)并用手撥(bo)打EP管底(di)輕輕混(hun)勻，避免(mian)產(chan)生(sheng)氣泡，立即插入冰中。
A. 測定(ding)轉化(hua)效率使用1 μl 10 pg/μl的對(dui)照質粒(li) pUC19；
;B. 對(dui)于連(lian)(lian)接產(chan)物(wu)，大(da)部分公司的T4連(lian)(lian)接酶反應(ying)體(ti)(ti)系或50度反應(ying)重組(zu)體(ti)(ti)系可與(yu)Stbl3電擊感受(shou)態混合(he)后電擊轉化，無(wu)需 進(jin)行DNA純化，但DNA濃度不(bu)能過高(gao)，DNA濃度不(bu)超(chao)過100 ng/μl，體積不(bu)超(chao)過5 μl/50 μl感受(shou)態。
C. 對(dui)鹽濃度(du)較高的DNA溶液或(huo)反應體系(xi)請用乙(yi)醇(chun)沉淀(dian)DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸(xuan)，然(ran)后與Stbl3電擊感受態(tai)混合進行(xing)電擊轉化。
3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合(he)物快速移(yi)到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋(gai)上(shang)杯蓋(gai)。
4. 啟動電(dian)(dian)轉(zhuan)儀(yi)，設(she)置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電(dian)(dian)轉(zhuan)儀(yi)推(tui)薦參數，也可按所用電(dian)(dian)轉(zhuan)儀(yi)推(tui)薦的參數操作），將電(dian)(dian)擊(ji)杯(bei)快(kuai)速放入電(dian)(dian)轉(zhuan)槽中，電(dian)(dian)擊(ji)完成快(kuai)速插入冰中。
5. 2分(fen)鐘后從冰中取(qu)出電(dian)擊杯，放室(shi)溫，加入700 μl不含抗生(sheng)素(su)的無菌S.O.C. 培(pei)養(yang)基（室(shi)溫），用1ml 槍吹吸電(dian)擊杯底部數次(ci)混(hun)勻后，轉移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補(bu)加S.O.C. 培(pei)養(yang)基至10 ml。37℃，225 rpm復(fu)蘇60分(fen)鐘。
6. 5000 rpm離心(xin)一分鐘收菌(jun)，重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的(de)S.O.C平(ping)板上（因菌(jun)量較大，若全(quan)部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個）。將平(ping)板倒置放于37℃培養箱過(guo)夜培養13-17小時(shi)。
S.O.C 培養基(ji)配方
2% Tryptone
0.5% Yeast Extract
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM glucose
PH-7.0
S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
注意事項(xiang)
1. 加入DNA時體積(ji)不應大于(yu)感受態體積(ji)的1/10。
2. 電(dian)擊感受態細(xi)胞(bao)加入電(dian)擊杯(bei)應避免產生氣(qi)泡，氣(qi)泡會(hui)增加弧光放(fang)電(dian)風險。
3. 當DNA不純(chun)或存在鹽(yan)，乙醇，蛋白及(ji)緩沖液等污染(ran)時，轉(zhuan)化(hua)效率急劇下降(jiang)。
4. 電(dian)擊杯里的(de)離子可增加溶液的(de)電(dian)導，增大(da)在含有(you)細胞和(he)DNA的(de)溶液中(zhong)產生電(dian)流和(he)弧光放電(dian)的(de)風(feng)險(xian)。
5. 若(ruo)轉(zhuan)化(hua)大質(zhi)粒或(huo)想獲(huo)得較高(gao)(gao)轉(zhuan)化(hua)效率，推薦使用高(gao)(gao)純質(zhi)粒提取(qu)試劑盒提取(qu)質(zhi)粒。質(zhi)粒增(zeng)大一(yi)倍，轉(zhuan)化(hua)效率下降(jiang)一(yi)個數量級。
6. 對于(yu)連(lian)接(jie)產物轉(zhuan)化(hua)，部分公司(si)的(de)(de)連(lian)接(jie)體系或重組(zu)(zu)體系(例如(ru)：Thermo，NEB公司(si)的(de)(de)T4 連(lian)接(jie)酶系統，NEB，天根的(de)(de)50度反應重組(zu)(zu)系統)可以(yi)直接(jie)Stbl3電(dian)(dian)擊感受(shou)態混(hun)合后電(dian)(dian)擊轉化，無需純化，但DNA濃度不能(neng)過高(gao)，最好不超過100 ng/μl。過高(gao)濃度連接產(chan)(chan)物或過大體積(ji)連接產(chan)(chan)物會降低轉化效(xiao)率，增加弧光放(fang)電(dian)(dian)的風(feng)險(xian)。
7. 混入質粒(li)時應輕(qing)柔(rou)操作，吸取(qu)感受(shou)態細胞時避(bi)免用力過(guo)猛，以免剪切力過(guo)大損傷細胞膜(mo)，降低轉(zhuan)化效率。轉(zhuan)化高(gao)濃度的質粒(li)或連接產物可相應減少最終(zhong)用于涂(tu)板的菌量(liang)。
8. 電擊感受態細(xi)胞(bao)最(zui)好保(bao)存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chu)存會導致轉化效率會下降(jiang)。
